일반 현미경과 형광 현미경의 차이점
형광현미경은 자외선을 광원으로 하여 검사 대상물에 조사하여 대상물이 빛을 내도록 한 후 현미경으로 대상물을 관찰한다. 주로 면역 형광 세포에 사용됩니다. 주로 접안렌즈와 대물렌즈의 배율을 통해 시료의 형광 이미지를 관찰하는 광원, 필터 플레이트 시스템 및 광학 시스템으로 구성됩니다. 이 형광 현미경과 일반 광학 현미경의 차이점을 살펴보겠습니다.
1. 조명 방식에 있어서
형광 현미경의 조명 방법은 일반적으로 episcopic입니다. 즉 광원이 대물 렌즈를 통해 테스트 샘플에 투사됩니다.
2. 해상도 측면에서
형광 현미경은 자외선을 광원으로 사용합니다. 파장은 상대적으로 짧지만 해상도는 일반 광학현미경보다 높다.
3. 필터의 차이
형광현미경은 2개의 특수 필터를 사용하는데, 광원 앞에는 가시광선을 걸러내고, 대물렌즈와 접안렌즈 사이에는 자외선을 걸러내어 사람의 눈을 보호할 수 있다.
형광현미경도 광학현미경의 일종인데 주로 형광현미경에 의해 여기되는 파장이 짧기 때문에 형광현미경과 일반현미경의 구조와 용도에 차이가 있다. 대부분의 형광현미경은 미약한 빛을 잘 포착하는 기능을 가지고 있어 매우 약한 형광 하에서도 이미징 능력이 좋습니다. 최근 몇 년 동안 형광 현미경의 지속적인 개선과 함께 노이즈도 크게 감소했습니다. 따라서 점점 더 많은 형광 현미경이 사용됩니다.
이광자형광현미경에 대한 지식
2광자 여기의 기본 원리는 다음과 같습니다. 높은 광자 밀도의 경우 형광 분자는 두 개의 장파장 광자를 동시에 흡수할 수 있으며 소위 여기 상태 수명의 짧은 기간 후에 단파장 광자를 방출할 수 있습니다. . ; 그 효과는 파장이 긴 파장의 절반인 광자를 사용하여 형광 분자를 여기시키는 것과 동일합니다. 2광자 여기에는 높은 광자 밀도가 필요합니다. 세포를 손상시키지 않기 위해 2광자 현미경은 고에너지 모드 잠금 펄스 레이저를 사용합니다. 이 레이저에서 방출되는 레이저는 피크 에너지가 높고 평균 에너지가 낮으며 펄스 폭은 100펨토초에 불과하고 주파수는 80~100메가헤르츠에 달할 수 있습니다. 높은 개구수의 대물렌즈를 사용하여 펄스 레이저의 광자를 집속할 때 대물렌즈의 초점에서 광자 밀도가 가장 높고 2광자 여기는 대물렌즈의 초점에서만 발생하므로 2광자 현미경은 공초점 핀홀이 필요하지 않아 형광 검출 효율이 향상됩니다.
일반적인 형광 현상은 여기광의 낮은 광자 밀도로 인해 형광 분자가 동시에 하나의 광자만 흡수할 수 있으며, 그 후 방사 전이를 통해 형광 광자를 방출하는데, 이것이 단일 광자 형광입니다. 레이저를 광원으로 사용하는 형광 여기 공정의 경우 2광자 또는 다광자 형광이 발생할 수 있습니다. 이때 사용되는 여기 광원의 강도는 높고 광자 밀도는 동시에 두 개의 광자를 흡수하는 형광 분자의 요구 사항을 충족합니다. 일반 레이저를 여기 광원으로 사용하는 과정에서 광자 밀도는 여전히 2 광자 흡수 현상을 일으키기에 충분하지 않습니다. 일반적으로 펨토초 펄스 레이저가 사용되며 순간 전력은 메가와트 수준에 이를 수 있습니다. 따라서 2광자 형광의 파장은 여기광의 파장보다 짧으며, 이는 여기 파장의 절반에서 여기로 인해 생성되는 효과와 동일합니다.
2광자 형광 현미경 검사에는 다음과 같은 많은 이점이 있습니다.
1) 장파장 빛은 단파장 빛보다 산란의 영향을 덜 받고 시편을 쉽게 투과한다.
2) 초점면 외부의 형광 분자는 여기되지 않으므로 더 많은 여기광이 초점면에 도달할 수 있으므로 여기광이 더 깊은 표본을 통과할 수 있습니다.
3) 장파장 근적외선은 단파장보다 세포에 대한 독성이 적습니다.
4) 2광자현미경으로 검체를 관찰할 때 광퇴색과 광독성은 초점면에서만 일어난다. 따라서 2광자 현미경은 두꺼운 표본을 관찰하거나 살아있는 세포를 관찰하거나 반점 광표백 실험에 단일 광자 현미경보다 더 적합합니다.
공초점 형광 현미경에 대한 지식
공초점 형광 현미경의 기본 원리: 점광원을 사용하여 시편을 조사하고 초점면에 잘 정의된 작은 광점을 형성합니다. 스플리터로 구성되어 있습니다. 빔 스플리터는 형광을 검출기로 직접 보냅니다. 광원과 검출기 앞에 각각 조명 핀홀과 검출 핀홀이라고 하는 핀홀이 있습니다. 둘의 기하학적 크기는 약 100-200nm로 동일합니다. 초점면의 광점에 대해 두 개는 공액입니다. 즉, 광점이 일련의 렌즈를 통과하고 최종적으로 조명 핀홀과 검출 핀홀에 동시에 초점을 맞출 수 있습니다. 이러한 방식으로, 초점면으로부터의 빛은 감지 구멍의 범위 내에서 수렴될 수 있는 반면, 초점면 위 또는 아래로부터 산란된 빛은 감지 구멍 외부에서 차단되어 이미지화될 수 없습니다. 레이저는 샘플을 한 점씩 스캔하고 핀홀을 감지한 후 광전자 증배관은 해당 광점의 공초점 이미지를 한 점씩 얻습니다. 이 이미지는 디지털 신호로 변환되어 컴퓨터로 전송되고 최종적으로 명확한 전체 초점면의 공초점 이미지를 화면에 표시합니다.
각 초점면 이미지는 실제로 표본의 광학 단면입니다. 이 광학 단면은 항상 광학 얇은 단면이라고도 하는 특정 두께를 가집니다. 초점에서 빛의 세기가 비초점에서보다 훨씬 크고 무초점 평면 빛이 핀홀에 의해 걸러지기 때문에 공초점 시스템의 피사계 심도는 대략 0이 되고 Z축을 따라 주사합니다. -축은 샘플의 초점을 맞춘 지점에서 2차원 광학 섹션을 관찰하여 광학 단층 촬영을 실현할 수 있습니다. XY 평면(초점면) 스캐닝과 Z축(광축) 스캐닝을 결합하여 연속 레이어의 2차원 이미지를 축적하고 특수 컴퓨터 소프트웨어로 처리하여 샘플의 3차원 이미지를 얻을 수 있습니다.
즉, 검출 핀홀과 광원 핀홀은 항상 같은 지점에 초점이 맞춰져 있어 초점면 외부에서 여기된 형광이 검출 핀홀로 들어갈 수 없다.
레이저 공초점의 작동원리를 간단하게 표현하면 레이저를 광원으로 사용하고 기존의 형광현미경 이미징에 레이저 스캐닝 장치와 공액 포커싱 장치를 더해 디지털 영상 획득과 컴퓨터 제어를 통해 처리합니다.
