형광현미경 원리 응용 및 사용
(1) 형광현미경의 원리 및 구조적 특징: 형광현미경은 발광효율이 높은 점광원을 사용하여 필터 시스템을 통해 특정 파장의 빛(자외선 3650in 또는 보라색 청색광 4200in 등)을 방출합니다. 표본을 자극하는 여기광으로. 내부의 형광물질이 다양한 색상의 형광을 발산한 후 대물렌즈와 접안렌즈의 배율을 통해 관찰합니다. 이처럼 대비가 강한 배경에서는 형광이 매우 약하더라도 식별이 쉽고 감도가 높습니다. 주로 세포의 구조와 기능, 화학적 조성을 연구하는데 사용됩니다. 형광 현미경의 기본 구조는 일반 광학 현미경과 일부 액세서리(예: 형광 광원, 여기 필터, 2색 빔 분할기 및 차단 필터 등)로 구성됩니다. 형광등 광원 - 일반적으로 다양한 파장의 빛을 방출할 수 있는 초고압 수은등(50-200W)을 사용하는데, 각 형광체마다 가장 강한 형광을 발생시키는 여기 파장이 있으므로 여기필터(일반적으로, 자외선, 보라색, 파란색 및 녹색 여기 필터가 있습니다. 이는 특정 파장의 여기광만 통과하여 표본을 조사하고 다른 빛은 흡수합니다. 각 물질은 여기광을 조사한 후 매우 짧은 시간에 조사 파장보다 긴 파장의 가시광선 형광을 방출합니다. 형광은 특이적이고 일반적으로 여기광보다 약합니다. 특정 형광을 관찰하려면 대물렌즈 뒤에 차단(또는 억제) 필터가 필요합니다. 여기에는 두 가지 기능이 있습니다. 하나는 여기광이 접안렌즈로 들어가는 것을 흡수하고 차단하여 형광을 방해하고 눈을 손상시키지 않는 것입니다. 다른 하나는 특정 형광을 선택하여 통과시켜 특정 형광 색상을 나타내는 것입니다. 두 개의 필터를 함께 사용해야 합니다.
광학 경로 측면에서 형광 현미경에는 두 가지 유형이 있습니다.
1. 투과형광현미경: 여기광원을 콘덴서렌즈를 통해 시료재료에 통과시켜 형광을 여기시킨다. 일반적으로 암시야 수집기가 사용되며 일반 수집기를 사용하여 여기광이 시료로 방향이 바뀌고 우회되도록 거울을 조정할 수도 있습니다. 이것은 오래된 형광현미경이다. 장점은 낮은 배율에서 형광이 강하다는 점이나, 배율이 커질수록 형광이 감소하는 단점이 있습니다. 따라서 더 큰 표본 재료를 관찰하는 것이 좋습니다.
2. 외피형광현미경은 현대에 개발된 새로운 형태의 형광현미경이다. 차이점은 여기광이 대물렌즈에서 시료 표면으로 떨어지는 점, 즉 조명 집광기와 형광 수집용 대물렌즈로 동일한 대물렌즈를 사용한다는 점이다. 광 우라늄으로부터 45도 떨어진 광 경로에 이색성 빔 스플리터를 추가해야 합니다. 여기광은 대물렌즈에 반사되어 샘플에 수집됩니다. 시료에서 발생한 형광과 대물렌즈의 렌즈면과 커버글라스 표면에서 반사된 여기광이 동시에 대물렌즈로 입사하고, 2색 빔분할기로 되돌아와 여기광이 형광과 분리되도록 한다 , 잔류 여기광은 차단 필터에 의해 흡수됩니다. 다양한 여기 필터/2색 빔 스플리터/차단 필터의 조합으로 변경하는 등 다양한 형광 반응 제품의 요구를 충족할 수 있습니다. 이런 종류의 형광현미경의 장점은 시야의 조명이 균일하고, 이미징이 선명하며, 배율이 클수록 형광이 강하다는 것입니다.
(2) 형광현미경의 사용법.
1. 광원을 켜면 초고압 수은 램프가 가장 밝은 지점에 도달하려면 몇 분 동안 예열해야 합니다.
2. 투과형광현미경은 광원과 콘덴서 사이에 필요한 여기 필터를 설치하고 대물 렌즈 뒤에 해당 차단 필터를 설치해야 합니다. Epi-형광 현미경은 필요한 여기 필터/이중 색상 빔 분할기/차단 필터 삽입물을 광 경로의 슬롯에 삽입해야 합니다.
3. 저배율 렌즈로 관찰하고, 다양한 형광 현미경 모델의 조정 장치에 따라 광원의 중심이 전체 조명 지점의 중심에 위치하도록 조정합니다.
4. 표본 조각을 놓고 초점을 맞춘 후 관찰하십시오. 사용 중에는 주의를 기울여야 합니다. 눈이 손상되지 않도록 엔드 필터를 직접 관찰하지 마십시오. 오일렌즈로 표본을 관찰할 때에는 형광이 없는 특수 오일렌즈를 사용해야 한다. 고압 수은 램프가 꺼지면 즉시 다시 켤 수 없으므로 테스트가 필요합니다. 5분 후에 다시 시작할 수 있습니다. 그렇지 않으면 불안정해지고 수은 램프의 수명에 영향을 미칩니다.
(3) 0.01% 아크리딘 오렌지 형광염료로 염색된 세포를 청자색 필터를 장착한 교육대 위에서 형광현미경으로 관찰한다. 핵과 세포질은 흥분되어 두 가지 다른 색상의 형광(진한 녹색과 주황색-빨간색)을 생성합니다.
