이-광자 형광 현미경에 대한 지식
2광자 여기의 기본 원리는 높은 광자 밀도에서 형광 분자가 2개의 장파장 광자를 동시에 흡수하고 소위 여기 상태 수명이라는 짧은 기간 후에 더 짧은 파장의 광자를 방출할 수 있다는 것입니다.- 그 효과는 장파장의 절반 파장을 가진 광자를 사용하여 형광 분자를 여기시키는 것과 같습니다. 2광자 여기에는 높은 광자 밀도가 필요하며, 세포 손상을 방지하기 위해 2{3}}광자 현미경은 고-에너지 모드-고정 펄스 레이저를 사용합니다. 이 레이저에서 방출되는 레이저는 높은 피크 에너지와 낮은 평균 에너지를 가지며, 펄스 폭은 100펨토초에 불과하고 주파수는 최대 80~100MHz입니다. 펄스 레이저의 광자의 초점을 맞추기 위해 높은 개구수 대물렌즈를 사용할 때 대물렌즈 초점의 광자 밀도가 가장 높으며 두-광자 여기는 대물렌즈의 초점에서만 발생합니다. 따라서 2-광자 현미경에는 공초점 핀홀이 필요하지 않아 형광 검출 효율성이 향상됩니다.
일반적인 형광 현상에서는 여기광의 광자 밀도가 낮기 때문에 형광 분자는 한 번에 하나의 광자만 흡수한 다음 복사 전이를 통해 다른 형광 광자를 방출할 수 있는데, 이를 단일 광자 형광이라고 합니다. 레이저를 광원으로 사용하는 형광 여기 공정의 경우 2-광자 또는 심지어 다광자 형광 현상이 발생할 수 있습니다. 이 경우 사용되는 여기 광원은 형광 분자가 두 개의 광자를 동시에 흡수해야 하는 요구 사항을 충족하는 높은 강도와 광자 밀도를 갖습니다. 일반 레이저를 여기광원으로 사용하는 과정에서 2-광자 흡수 현상을 일으키기에는 광자 밀도가 여전히 부족합니다. 일반적으로 펨토초 펄스 레이저가 사용되며 순간 출력은 메가와트 수준에 이릅니다. 따라서 2-광자 형광의 파장은 여기광의 파장보다 짧으며, 이는 절반 여기 파장 여기에 의해 생성되는 효과와 동일합니다.
