레이저 공초점 현미경의 특징과 응용
일반 현미경에서 관찰의 이미지 평면은 대물 렌즈의 초점 평면을 검출기와 겹쳐서 인접한 축 평면에서 격리되는 반면, 공초점 현미경에서는 회절 제한 지점으로 샘플을 조명하여 이러한 격리가 달성됩니다. 이러한 분리를 달성하고 해상도를 향상시키기 위해 이 빛 지점의 공액 초점에서 수집된 빛의 경로에 있는 핀홀을 사용하여 빛을 필터링하고 미광을 필터링합니다.
공액 시료층에서 다시 반사된 빛만 수집 광 경로의 핀홀을 통과할 수 있으며, 관련 없는 나머지 시료층 반사는 핀홀에 의해 차단됩니다. 이로 인해 해상도가 크게 향상됩니다. 아래에는 동일한 두꺼운 샘플에 대한 다차원 형광 현미경과 공초점 현미경을 나란히 비교한 내용이 나와 있습니다. 일련의 이미지를 서로 다른 초점면에서 촬영하면 일반적으로 "z-스택"이라고 하는 이미지가 생성됩니다. 이는 공초점 현미경으로 제공되는 해상도 및 대비 이득과 이러한 이득의 기본 이유를 보여줍니다. 이미징 평면이 조직 위에 있는 스택 상단의 이미지를 검사하면 형광 이미지에서 많은 양의 산란광이 나타나는 반면 공초점 현미경 이미지는 검은색으로 나타나는 것을 볼 수 있습니다. 축 방향의 PSF 감소는 z-스택 중간의 광학 인터페이스에서 관찰되는 분해능의 차이에 직접적으로 기여합니다.
광학 슬라이스 스캐닝 이미징
레이저 스캐닝 공초점 현미경의 또 다른 특징은 스캐닝 이미징 기술이라는 점입니다. 기존의 광시야 조명 기술은 육안이나 검출기로 이미지를 직접 캡처할 수 있도록 샘플 전체를 조명하지만, LSCM은 하나 이상의 집중된 광선을 사용하여 샘플을 스캔하므로 결과 이미지를 이미지라고 합니다. 다음 다이어그램에 표시된 대로 광학 슬라이스. 기존의 광시야 조명과 레이저 스캐닝 공초점 조명의 차이점은 다음과 같습니다.
따라서 현대 공초점 현미경의 실제적인 방법이 아래 그림에 나와 있습니다. 레이저의 여기광은 이색성 거울을 통과하여 시료의 x 방향과 y 방향으로 한 쌍의 검류계 거울을 통해 스캔되며 시료의 여기(또는 반사)는 핀홀을 통해 PMT로 전달됩니다. 검출기에 기록되고, 기록된 스캔 이미지는 컴퓨터에 의해 재구성되어 샘플의 실제 이미지를 생성합니다.
