레이저 공초점 현미경 - 기능 및 응용
레이저 스캐닝 공초점 현미경(LSCM)은 공액 초점 기술을 기반으로 설계된 현미경의 일종입니다. 즉, 레이저 광원, 측정할 샘플 및 검출기가 모두 서로 공액 위치에 있습니다.
근본적인
일반 현미경에서는 대물렌즈의 초점면을 검출기와 일치시켜 관찰의 이미지 평면이 인접한 축 평면과 격리되는 반면, 공초점 현미경에서는 회절 제한 광점을 사용하여 시료와 A를 조명합니다. 핀홀은 광점의 공액 초점에서 수집된 빛 경로에 사용되어 미광을 필터링하여 이러한 격리 효과를 만들어 해상도를 향상시킵니다.
이미징 기능
광학 섹션 스캐닝 이미징
레이저 스캐닝 공초점 현미경의 또 다른 특징은 스캐닝 이미징 기술이라는 점입니다. 기존의 광시야 조명 기술은 시료 전체를 조명하기 때문에 육안이나 검출기로 직접 이미지를 포착할 수 있지만 LSCM은 빔을 사용하거나 다중 집속된 빔이 시료를 통과해 스캔하고 이미지화한다. 결과 이미지를 광학 섹션이라고 합니다. 다음은 기존의 광시야 조명 방식과 레이저 스캐닝 공초점 조명 방식의 차이점을 보여줍니다.
따라서 현대 공초점현미경의 실제 작동방식은 아래 그림과 같다. 레이저에서 방출된 여기광은 이색성 거울을 통과하고 한 쌍의 검류계를 통해 샘플의 x 방향과 y 방향으로 스캔됩니다. 샘플의 여기(또는 반사)는 빛이 핀홀을 통해 PMT 검출기로 들어와 기록되며, 기록된 스캔 이미지는 컴퓨터에 의해 재구성되어 실제 샘플 이미지를 재구성합니다.
다양한 초점면에 "z-stack" 이미지 생성
공액 시료층에서 다시 반사된 빛만 수집 광 경로의 작은 구멍을 통과할 수 있으며 나머지 관련 없는 시료층 반사는 작은 구멍에 의해 차단됩니다. 이로 인해 해상도가 크게 향상될 수 있습니다. 동일한 두꺼운 샘플의 다차원 형광 현미경과 공초점 현미경을 나란히 비교합니다. 일련의 이미지를 서로 다른 초점면에서 촬영하면 일반적으로 "z-스택"이라고 하는 이미지가 생성될 수 있습니다. 이는 공초점 현미경이 제공하는 해상도 및 대비 이득과 이러한 이득의 기본 원인을 보여줍니다. 조직 위의 이미징 평면을 사용하여 스택 상단의 이미지를 검사하면 형광 이미지에서 많은 양의 산란광이 나타나는 반면 공초점 현미경 이미지는 검은색으로 나타나는 것을 볼 수 있습니다. 축방향 PSF의 이러한 감소는 z-스택 중간의 광학 인터페이스에서 관찰되는 해상도 차이를 직접적으로 초래합니다.
광시야 조명에 비해 해상도가 크게 향상되었습니다.
형광현미경에서는 단일 지점에서 방출되는 빛의 세기를 점 확산 함수(PSF)로 표현하며 그 패턴은 Airy disk입니다. 형광 시스템의 분해능은 Airy 디스크의 반경으로 설명할 수 있으며, 이는 대물 렌즈의 개구수와 여기광의 파장에 따라 결정됩니다.
