형광현미경의 원리
형광 현미경은 일반 광학 현미경과 다릅니다. 일반 광원의 조명 아래에서 표본을 관찰하는 대신 특정 파장의 빛(보통 자외선, 청자색광)을 이용해 현미경으로 표본의 형광 물질을 여기시켜 형광을 발산하게 한다. 따라서 형광현미경의 광원은 직접적인 조명이 아닌 시료 내부의 형광물질을 여기시키는 에너지원으로 기능한다. 시편을 관찰할 수 있는 이유는 광원의 조명 때문인데, 시편의 형광물질이 들뜬 빛 에너지를 흡수한 후 나타나는 형광 현상이다.
형광현미경의 특징은 그 광원이 특정 파장 범위의 많은 양의 여기광을 공급할 수 있어 시험 시료의 형광체가 필요한 강도의 여기광을 얻을 수 있다는 점을 알 수 있다. 동시에 형광 현미경에는 해당 필터 시스템이 있어야 합니다.
형광 현미경은 면역형광 조직화학에서 필수적인 도구입니다. 초고전압 광원, 필터 시스템(여기 및 억제 필터 플레이트 포함), 광학 시스템 및 촬영 시스템 및 기타 주요 구성 요소로 구성됩니다. 특정 파장의 빛을 사용하여 시료를 여기시켜 형광을 방출합니다.
형광 여기 방식: 빛의 파장 범위에 따라 UV 여기 방식(자외선 조명 방식 사용)과 BV 여기 방식(청자색광 사용)의 두 가지 유형으로 나눌 수 있습니다. UV 여기 방식은 여기를 위해 400nm보다 짧은 근자외선을 사용합니다. 이 방법에는 가시광선이 없기 때문에 관찰된 형광은 염료 고유의 형광을 나타내며, 표본의 특정 형광을 배경 조직의 자가형광과 쉽게 구별할 수 있습니다.
BV 여기 방법은 자외선에서 청색광으로 여기하기 위해 404nm 및 434nm를 기반으로 합니다. 이 방법은 청색광을 이용하여 시료를 조사하므로 형광 관찰 시스템의 차단 필터는 청색광을 완전히 차단하고 필요한 녹색 및 황색 형광을 완전히 통과시킬 수 있는 필터를 사용해야 합니다. 형광 항체 분석을 위한 형광 염료. 여기광의 최대 흡수 파장은 형광의 최대 방출 파장에 상대적으로 가깝기 때문에 BV 여기 방식에 사용되는 필터는 날카로운 컷오프 필터를 사용해야 합니다. 이 방법은 청색광을 여기광으로 사용할 수 있으므로 형광 안료의 흡수 효율이 더 높고 더 밝은 이미지를 얻을 수 있습니다. 단점은 500nm 이하의 형광은 보이지 않고, 500nm 이상의 형광은 전체 이미지가 노랗게 보인다는 점입니다. 형광항체법에서는 형광색소 특유의 색으로 형광색소의 특이성을 판단하는 경우가 많다. 따라서 미묘한 특이성을 논의할 때 위에서 언급한 BV 여기 방법의 단점이 종종 큰 영향을 미칩니다.
정리하면 형광현미경의 조명은 집광기의 구조와 여기광의 파장에 따라 다음 세 가지로 생각할 수 있다.
① 형광 이미지의 콘트라스트 요구 사항의 관점에서 UV 여기 암시야 집중 장치가 조명에 사용됩니다.
② 영상의 밝기를 고려할 때 BV excitation filter가 암시야 관찰 효율이 가장 높다.
③ UV excitation filter 암시야 관찰과 BV excitation dark field concentrator 조명의 특성은 이 두 가지 조명 방식의 중간이라고 볼 수 있지만 전자가 암시야 특성이 강하고 더 밝은 이미지를 표시합니다. 대비가 작습니다. 후자는 암시야 광 경로의 속성을 유지하므로 표시된 이미지가 더 어둡고 대비가 향상됩니다. 실제로 형광현미경을 사용할 때는 시료의 요구사항에 가장 적합한 조명 방법을 사용하여 관찰해야 합니다.
콘트라스트가 가장 좋은 UV-excited dark field condenser가 빛을 발하더라도 시료에 의해 굴절되거나 산란되는 자외선 여기광의 일부가 대물렌즈에 들어간다는 점에 유의해야 합니다. 자가형광은 이미지 반응을 악화시킬 수 있습니다. 따라서 차단 필터로 접안 렌즈 앞에 UV 흡수 필터를 사용해야 합니다.
