2광자형광현미경의 기술적 특성 및 활용 기술
이광자 형광 현미경은 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 이광자 여기 기술을 결합한 새로운 기술입니다.
2광자 여기의 기본 원리는 다음과 같습니다. 높은 광자 밀도의 경우 형광 분자는 두 개의 장파장 광자를 동시에 흡수할 수 있으며 소위 여기 상태 수명의 짧은 기간 후에 더 짧은 파장의 광자를 방출할 수 있습니다. . ; 그 효과는 형광 분자를 여기시키기 위해 긴 파장의 절반 파장을 가진 광자를 사용하는 것과 같습니다. 2광자 여기에는 높은 광자 밀도가 필요합니다. 세포를 손상시키지 않기 위해 2광자 현미경은 고에너지 모드 잠금 펄스 레이저를 사용합니다. 이 레이저에서 방출되는 레이저는 피크 에너지가 높고 평균 에너지가 낮으며 펄스 폭은 100펨토초에 불과하고 주기는 80~100메가헤르츠에 달할 수 있습니다. 높은 개구수의 대물렌즈를 사용하여 펄스 레이저의 광자를 집속할 때 대물렌즈의 초점에서 광자 밀도가 가장 높고 2광자 여기는 대물렌즈의 초점에서만 발생하므로 2광자 현미경은 공초점 핀홀이 필요하지 않아 형광 검출 효율이 향상됩니다. 형태학, 분자 세포 생물학, 신경 과학 및 약리학 분야에서 중요한 연구 방법입니다.
1. 이광자 현미경의 등장 배경 - 기존 레이저 공초점 현미경의 두 가지 한계:
1) 하나는 광독성 현상이다: 공초점 핀홀은 고해상도 이미지를 얻기 위해 충분히 작아야 하고, 작은 조리개는 초점면에서 방출되는 형광을 포함하여 시료에서 방출되는 형광의 많은 부분을 차단할 것이기 때문에, 해당하는 예, 여기광은 충분한 신호 대 잡음비를 얻기에 충분히 강해야 합니다. 고강도 레이저는 연속 스캐닝 중에 형광 염료를 빠르게 퇴색시키고 스캐닝이 진행됨에 따라 형광 신호가 점점 약해집니다.
2) 광독성은 또 다른 문제입니다. 레이저 조사 하에서 많은 형광 염료 분자는 단일항 산소 또는 자유 라디칼과 같은 세포독소를 생성하므로 여기광의 스캐닝 시간과 광학 출력 밀도는 샘플 밀도를 유지하기 위해 실험에서 제한되어야 합니다. 활동적인. 활성 시료에 대한 연구에서, 특히 활성 시료의 성장 및 발달의 다양한 단계, 광표백 및 광독성은 이러한 연구를 매우 제한적으로 만듭니다.
2. 일반적으로 2광자 현미경에 자외선 여기 레이저를 장착할 필요가 없다고 말하는 이유는 무엇입니까?
2광자 현미경은 2광자 여기 효과에 기반한 형광 여기 기술입니다. 형광 염료 분자는 두 개의 저에너지 광자를 동시에 흡수하여 여기될 수 있습니다(형광 분자에 도달하는 두 광자 사이의 시간 간격은 1펨토초 미만입니다. ) 여기 효과는 1/2 파장의 고에너지 광자를 흡수하는 것과 동일할 수 있습니다. 예를 들어 적색 파장에서 두 개의 광자를 흡수하는 것은 분자가 자외선을 흡수하는 것과 같습니다. 장파장 광자는 세포에 쉽게 흡수되지 않아 살아있는 세포에 대한 광독성이 적고 광퇴색도 적다. 이러한 방식으로 자외선 여기 기능을 할 뿐만 아니라 샘플에 대한 자외선의 손상을 방지합니다.
3. 이광자현미경의 레이저는 무엇이 특별한가요?
2광자 흡수의 확률은 2개의 입사 광자가 공간과 시간에서 얼마나 밀접하게 일치하는지에 따라 달라집니다(2개의 광자는 10-18초 내에 도착해야 함). 2광자 흡수 단면적이 작고 광자 플럭스가 큰 영역의 형광단만 여기됩니다. 따라서 사용되는 대부분의 레이저는 티타늄 사파이어 레이저로 피코초 또는 펨토초 스캔 속도를 달성할 수 있고 피크 출력이 매우 높고 평균 출력이 낮아 광퇴색 및 광독성을 줄이거나 없앨 수 있습니다. 가장 중요한 것은 두 광자의 동시 여기를 보장할 수 있는 작은 범위에서 매우 높은 밀도의 광자를 제공하는 것입니다.
4. 2광자 여기의 장점은 무엇입니까?
1) 염료의 선택도 증가: 공초점 시스템 레이저(Ar, Ar/Kr, HeNe)의 여기광 범위는 488nm- 647nm입니다. 이는 예를 들어 DAPI, Hoescht와 같은 UV 여기 형광 염료로 실험하는 것을 의미합니다. 2광자의 여기 파장은 단일 광자의 두 배이므로 자외선에 의해 여기된 염료는 근적외선에 의해 여기될 수 있습니다.
2) 광표백 감소: 광표백 감소로 인해 CFP/YFP를 사용한 형광 공명 에너지 전달(FRET) 실험의 성공률이 높아집니다.
3) 특별한 대물 렌즈가 필요하지 않습니다. 하드웨어 관점에서 근적외선 파장을 가진 UV 여기 염료의 여기에는 특별한 UV 광학 부품이 필요하지 않습니다.
4) 신호대 잡음비 개선: 여기광 파장과 방출광 파장의 차이가 커서 신호대 잡음비가 향상됩니다.
5) 초점에 국한된 표백: 대물렌즈의 초점에서만 형광 여기가 일어나기 때문에 공초점 핀홀이 필요하지 않습니다. 이것은 빛 감지를 향상시키고 광표백은 초점에서만 발생합니다.
6) 검체 투과 용이: 적외선 파장의 빛은 세포에 의해 쉽게 산란되지 않고 더 깊은 검체까지 투과할 수 있습니다.
5. 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 비교할 때 이광자 현미경의 가장 큰 개선점은 무엇입니까?
1) 감소된 광표백.
2) 광독성 감소.
3) 흩어지기 쉽지 않고 뇌 절편과 같은 두꺼운 시료를 통과하기 쉽습니다.
