(2- 광자, 공 초점) 형광 현미경과 일반 현미경의 차이

(2- 광자, 공 초점) 형광 현미경과 일반 현미경의 차이

2- 광자 여기의 기본 원리는 높은 광자 밀도에서 형광 분자가 동시에 2 개의 긴 파장 광자를 흡수하고 소위 여기 상태 수명의 짧은 기간 후 짧은 파장 광자를 방출 할 수 있다는 것입니다. 효과는 형광 분자를 자극하기 위해 긴 파장의 절반을 가진 광자를 사용하는 것과 동일합니다. 2 개의 광자 여기에는 높은 광자 밀도가 필요하며, 세포가 손상되지 않기 위해 2 광자 현미경은 고 에너지 모드로 고정 된 펄스 레이저를 사용합니다. 이 레이저에 의해 방출되는 레이저는 피크 에너지가 높고 평균 에너지가 낮으며 펄스 폭은 100 펨토초의 펄스 폭과 최대 80 ~ 100 메가 헤르츠의 주파수입니다. 펄스 레이저의 광자에 초점을 맞추기 위해 높은 수치 조리개 대물 렌즈를 사용하는 경우, 대물 렌즈의 초점에서의 광자 밀도는 가장 높으며 2 광자 여기는 대물 렌즈의 초점에서만 발생합니다. 따라서, 2 광자 현미경은 공 초점 핀홀이 필요하지 않아서 형광 검출의 효율을 향상시킨다.

일반적으로 형광 현상에서, 여기 광의 광자 밀도가 낮기 때문에, 형광 분자는 한 번에 하나의 광자 만 흡수 한 다음 단일 광자 형광으로 알려진 방사선 전이를 통해 다른 형광 광자를 방출 할 수있다. 광원으로 레이저를 사용하는 형광 여기 공정의 경우, 2 광자 또는 다산 형광 현상이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 사용 된 여기 광원은 형광 분자가 동시에 2 개의 광자를 흡수하는 요구 사항을 충족시키는 높은 강도 및 광자 밀도를 갖는다. 일반 레이저를 여기 광원으로 사용하는 과정에서, 광자 밀도는 여전히 2 광자 흡수 현상을 생성하기에 충분하지 않다. 일반적으로 펨토초 펄스 레이저가 사용되며 순간 전력은 메가 와트 수준에 도달합니다. 따라서, 2- 광자 형광의 파장은 절반 흥분 파장 여기에 의해 생성 된 효과와 동등한 여기 광의 파장보다 짧다.

공 초점 형광 현미경과 관련된 지식
공 초점 형광 현미경의 기본 원리는 포인트 광원을 사용하여 시편을 조사하여 초점 평면에 잘 정의 된 작은 광 지점을 형성하는 것입니다. 조사 후이 지점에서 방출 된 형광은 대물 렌즈에 의해 수집되고 원래의 조사 경로를 따라 이막 미러로 구성된 빔 스플리터로 다시 전송됩니다. 분광계는 형광을 검출기로 직접 보냅니다. 조명 핀홀과 검출 핀홀이라고 불리는 광원과 검출기 앞에는 핀홀이 있습니다. 둘의 기하학적 치수는 일관성이 있으며 대략 100-200 nm; 초점 평면의 광 지점과 비교하여,이 둘은 접합체이며, 이는 조명 지점이 일련의 렌즈를 통과하고 궁극적으로 조명 핀홀과 검출 핀홀에 동시에 초점을 둘 수 있음을 의미합니다. 이러한 방식으로, 초점 평면의 빛은 검출 구멍의 범위 내에서 수렴 할 수 있지만, 초점 평면 위 또는 아래로부터 산란 된 빛은 검출 구멍 외부에서 차단되며 이미지화 될 수 없다. 레이저로 샘플 포인트를 스캔하면 핀홀을 감지 한 후 광전자 튜브는 광 스폿 포인트의 해당 공 초점 이미지를 포인트로 얻고 디지털 신호로 변환하여 컴퓨터로 전송하고 마지막으로 화면에서 전체 초점 평면의 명확한 공 초기 이미지로 집계합니다.