광학현미경의 주된 관찰방법은 형광관찰이다.
형광은 형광 물질이 특정 파장의 빛을 조사할 때 거의 동시에 더 긴 파장의 빛을 방출하는 과정을 말합니다(그림 1). 특정 파장(여기 파장)의 빛이 형광단에 있는 것과 같은 분자에 부딪히면 광자 에너지가 분자의 전자에 흡수됩니다. 다음으로 전자는 바닥 상태(S0)에서 더 높은 에너지 준위인 여기 상태(S1')로 전이합니다. 이 과정을 들뜸①이라고 합니다. 전자는 10-9–10-8초 동안 들뜬 상태를 유지하며, 그 동안 전자는 약간의 에너지를 잃습니다②. 전자가 여기 상태(S1)를 벗어나 기저 상태③로 돌아가는 과정에서 여기 과정에서 흡수된 나머지 에너지가 방출됩니다.
여기 상태에서 형광 분자의 체류 시간은 형광 수명이며 일반적으로 나노초 수준이며 형광 분자 자체의 고유한 특성입니다. 형광 수명 이미징 기술을 사용하는 FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging)을 FLIM(Fluorescence Lifetime Imaging)이라고 합니다. 형광 강도 이미징 외에도 분자 구조, 분자간 상호 작용 및 분자의 미세 환경을 얻기 위해 보다 심층적인 기능 및 정확한 측정을 얻을 수 있습니다. 기존의 광학 이미징으로는 얻기 어려운 정보.
형광의 또 다른 중요한 특성은 여기 피크와 방출 피크 사이의 파장 차이인 스톡스 이동입니다(그림 2). 일반적으로 방출 파장은 여기 파장보다 길다. 이는 형광 물질이 여기된 후 광자를 방출하기 전에 이완 과정을 통해 전자가 에너지의 일부를 잃기 때문입니다. 스토크스 이동이 더 큰 형광 물질은 형광 현미경으로 관찰하기가 더 쉽습니다.
형광 현미경 및 형광 필터 큐브
형광현미경은 관찰과 영상화를 위해 형광의 성질을 이용하는 광학현미경으로 세포생물학, 신경생물학, 식물학, 미생물학, 병리학, 유전학 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있다. 형광 이미징은 고감도, 고특이성의 장점을 가지고 있으며, 조직 및 세포 내 특정 단백질 및 소기관의 분포 관찰, colocalization 및 상호작용 연구, 이온 농도 변화와 같은 생명 역학 과정 추적에 매우 적합합니다. , 등.
세포에 있는 대부분의 분자는 형광을 발하지 않으며, 이를 보려면 형광 표지가 되어 있어야 합니다. 직접 표지(예: DAPI를 사용하여 DNA 표지) 또는 항체의 항원 결합 특성을 사용한 면역염색 또는 형광 단백질(예: GFP, 녹색 형광 단백질)을 사용하여 표적 단백질을 표지하는 등 형광 표지 방법에는 여러 가지가 있습니다. , 및 가역 바인딩. 합성 염료(예: Fura-2) 등.
현재 형광 현미경은 다양한 실험실 및 이미징 플랫폼의 표준 이미징 장비가 되었으며 일상적인 실험을 위한 좋은 도우미입니다. 형광 현미경은 주로 세 가지 범주로 나뉩니다: 직립 형광 현미경(슬라이싱에 적합), 도립 형광 현미경(슬라이싱을 고려하여 살아있는 세포에 적합), 형광 입체경(식물, 제브라피시(성체/배아)과 같은 더 큰 표본에 적합) ) , 메다카, 쥐/쥐 장기 등).
형광 필터 블록은 현미경 형광 이미징의 핵심 구성 요소입니다. 여기 필터, 방출 필터 및 이색 빔 스플리터의 세 부분으로 구성됩니다. 필터 휠에 설치됩니다. 예를 들어, Leica DMi8에는 6-포지션 필터 휠이 장착되어 있습니다(그림 3). 다른 현미경 휠의 위치 수는 다를 수 있으며 일부 현미경은 필터 블록 슬라이드를 사용합니다.
필터 블록은 형광 이미징에서 중요한 역할을 합니다. 여기 필터는 여기광을 선택하여 샘플을 여기시키고 다른 파장의 빛을 차단합니다. excitation filter를 통과한 빛은 dichroic mirror를 통과하고(그 기능은 excitation light를 반사하여 형광을 전달하는 것임), 반사 후 대물렌즈에 의해 초점이 맞춰지고 시료에 조사되어 해당 형광을 excitation, 즉 , 방출된 빛. 방출된 빛은 대물렌즈에서 집광되어 다이크로익 빔 스플리터를 통과하여 방출 필터에 도달합니다. 그림 4와 같이 여기 파장은 450-490nm이고, 다이크로익 미러는 510nm보다 짧은 빛은 반사하고 510nm보다 긴 빛은 투과하며 방출된 빛의 수신 범위는 520-560nm입니다.
