여러 초고해상도 현미경 기법 검토
기존 광학 현미경의 경우 빛의 회절로 인해 이미징 해상도가 약 250nm로 제한됩니다. 오늘날 초고해상도 기술은 이를 10배 이상 향상시킬 수 있습니다. 이 기술은 주로 세 가지 방법을 통해 달성됩니다. 구조화 조명 현미경(SIM); 유도 방출 고갈 현미경(STED). 초해상도 기술을 선택하는 방법은 모두가 관심을 갖는 것입니다. "안타깝게도 어떤 방법을 사용할지 결정하는 간단한 원칙이 없습니다."라고 영국 옥스퍼드 대학의 박사후 연구원인 Mathew Stracy는 말합니다. "각자 고유의 장점과 단점이 있습니다." 물론 과학자들은 특정 프로젝트에 적합한 방법을 선택하는 방법도 알아내고 있습니다. "바이오 이미징의 맥락에서 고려해야 할 핵심 요소에는 공간적 및 시간적 해상도, 광손상에 대한 민감도, 라벨링 용량, 샘플 두께, 배경 형광 또는 세포 자가 형광이 포함됩니다." 작동 방식 다양한 초고해상도 현미경은 다양한 방식으로 작동합니다. PALM 및 STORM의 경우 형광 마커의 일부만 주어진 순간에 여기되거나 광활성화되어 고정밀로 독립적인 위치 파악이 가능합니다. 모든 형광 라벨에 이 과정을 거치면 완전한 초고해상도 이미지가 생성됩니다. 2014년 노벨 화학상 수상자이자 막스 플랑크 생물물리화학연구소 소장인 스테판 헬(Stefan Hell)은 "PALM/STORM 시스템은 상대적으로 설정하기 쉽지만 적용하기 어렵다. 그룹은 광활성화 능력이 있어야 합니다. 한계 단점은 세포의 맥락에서 단일 형광 분자를 감지해야 하며 STED보다 신뢰성이 낮다는 것입니다." STED는 레이저 펄스를 사용하여 형광단을 여기시키고 링 모양의 레이저를 사용하여 형광단을 소광하여 초해상도를 위해 중간 나노미터 크기의 형광만 남깁니다. 전체 샘플을 스캔하면 이미지가 생성됩니다. "STED의 장점은 푸시 버튼 기술이라는 것"이라고 Hell은 설명했습니다. "표준 공초점 형광 현미경처럼 작동합니다." 또한 녹색 또는 노란색 형광 단백질 및 로다민 유래 염료와 같은 형광단을 사용하여 살아있는 세포를 이미지화할 수 있습니다. 파라메트릭 비교 모든 초고해상도 기술은 해상도 면에서 기존의 광학 현미경을 능가하지만 서로 다릅니다. SIM은 해상도를 약 100nm로 대략 두 배로 늘립니다. PALM 및 STORM은 15nm 표적을 분석할 수 있습니다. Hell에 따르면 STED는 살아있는 세포에서 30nm, 고정 세포에서 15nm의 공간 분해능을 제공합니다. 특정 애플리케이션의 경우 신호 대 잡음비도 고려해야 합니다. 경우에 따라 해상도는 낮지만 SNR이 높을수록 이미지가 더 좋아질 수 있습니다(해상도는 높지만 SNR은 낮음). 특히 살아있는 세포의 경우 이미지 획득 속도도 매우 중요합니다. "모든 초고해상도 기술은 기존의 형광 이미징 기술보다 느립니다."라고 Stracy는 말했습니다. "PALM/STORM은 가장 느리고 단일 이미지를 얻기 위해 수만 프레임이 필요하고 SIM은 수십 프레임이 필요하며 STED는 스캐닝 기술이므로 시야의 크기에 따라 획득 속도가 달라집니다." 살아있는 세포 또는 고정 이미징 세포 외에도 일부 과학자들은 물체가 어떻게 움직이는지 이해하기를 원합니다. Stracy는 정적 이미지뿐만 아니라 살아있는 세포의 생물학적 시스템의 역학을 이해하는 데 관심이 있습니다. 그는 PALM을 단일 입자 추적과 결합하여 살아있는 세포의 역학을 분석합니다. 이러한 방식으로 마커 분자가 기능을 수행할 때 마커 분자를 직접 추적할 수 있습니다. 그러나 그는 SIM이 분자 수준에서 이러한 동적 프로세스를 연구하는 데 적합하지 않지만 빠른 획득 속도 때문에 전체 염색체와 같은 더 큰 구조의 역학을 관찰하는 데 특히 적합하다고 생각합니다. 최신 결과 2017년 Hell의 팀은 MINFLUX 초고해상도 현미경을 Science에 보고했습니다. Hell에 따르면 이 초해상도 방법은 처음으로 1nm의 공간 해상도를 달성했습니다. 또한 다른 방법보다 최소 100배 빠르게 살아있는 세포의 개별 분자를 추적할 수 있습니다. 다른 과학자들도 MINFLUX 현미경을 높이 평가했습니다. Shechtman은 "새로운 애플리케이션과 접근 방식이 지속적으로 개발되고 있지만 두 가지 발전이 눈에 띕니다"라고 말했습니다. 하나는 민플럭스입니다. "매우 정확한 분자 포지셔닝을 얻기 위해 독창적인 접근 방식을 사용합니다." 두 번째 흥미로운 개발에 대해 Shechtman은 Stanford University의 WE Moerner와 그의 동료를 언급했습니다. Moerner는 2014년 노벨 화학상을 수상하기도 했습니다. 수상자 중 한 명. 형광 단일 분자의 이방성 산란으로 인한 이미징 해상도의 한계를 해결하기 위해 과학자들은 분자의 방향과 위치를 결정하기 위해 다른 여기 편광을 사용했습니다. 또한 그들은 섬세한 동공 표면을 발달시켰습니다. 이러한 기술은 구조를 지역화하는 능력을 향상시킵니다. 형광 라벨 정보 많은 초고해상도 애플리케이션에서 라벨은 정말 중요합니다. 관련 제품을 제공하는 회사도 있습니다. 예를 들어 독일의 Miltenyi는 Stefan Hell이 설립한 회사인 Abberior와 협력하여 초고해상도 현미경 염료를 위한 맞춤형 항체 접합 서비스를 제공했습니다. 다른 여러 회사에서도 일치하는 마커를 제공합니다. ChromoTek의 마케팅 담당자인 Christoph Eckert는 "우리의 Nano-Boosters는 매우 작고 1.5kDa에 불과하며 매우 구체적입니다."라고 말합니다. 이 단백질은 녹색 및 적색 형광 단백질(GFP 및 RFP)과 결합합니다. VHH 또는 나노바디로 알려진 알파카 항체 단편에서 파생되며 배치 간 변동 없이 우수한 결합 특성과 안정적인 품질을 제공합니다. 이러한 마커는 SIM, PALM, STORM 및 STED를 포함한 다양한 초해상도 기술에 적합합니다. 메릴랜드 대학교 의과대학 조교수인 Ai-Hui Tang과 동료들은 ChromoTek의 GFP-부스터와 STORM을 사용하여 신경계의 정보 전파를 탐구했습니다. 그들은 시냅스전 뉴런과 시냅스후 뉴런에서 나노컬럼이라고 불리는 분자 나노클러스터를 발견했습니다. 과학자들은 이 구조가 중추 신경계가 시냅스 효율성을 유지하고 조절하기 위해 간단한 원리를 사용한다는 것을 보여준다고 믿습니다. 다양한 버전의 초고해상도 이미징과 점점 더 많은 방법이 과학자들을 생물학적 신비에 더욱 깊이 파고들게 하고 있습니다. 가시광선의 회절 한계를 깨면 생물학자들은 세포의 활동을 "면밀히 모니터링"할 수도 있습니다.
