공초점형광현미경에 대한 실무 지식

공초점형광현미경에 대한 실무 지식

공초점 형광 현미경의 기본 원리: 점 광원을 사용하여 표본을 조명하여 초점면에 작고 잘 정의된 광점을 형성합니다. 조명된 후 스폿에서 방출된 형광은 대물 렌즈에 의해 수집되어 원래 조명 광 경로를 따라 이색성 거울로 반환됩니다. 빔 스플리터를 구성합니다. 분광계는 형광을 검출기로 직접 보냅니다. 광원과 검출기 앞에는 핀홀이 있는데, 이를 각각 조명핀홀, 검출핀홀이라고 합니다. 두 가지의 기하학적 치수는 약 100-200nm로 일관됩니다. 초점면의 광점에 비해 두 개는 공액입니다. 즉, 광점이 일련의 렌즈를 통과하여 궁극적으로 조명 핀홀과 감지 핀홀에 동시에 초점을 맞출 수 있습니다. 이러한 방식으로 초점면의 빛은 감지 구멍 범위 내에 집중될 수 있지만, 초점면 위 또는 아래에서 산란된 빛은 감지 구멍 외부에서 차단되어 이미지를 얻을 수 없습니다. 샘플은 레이저로 점 단위로 스캔되고 감지 핀홀 뒤의 광전자 증배관도 점 단위로 해당 광의 공초점 이미지를 얻습니다. 이 공초점 이미지는 디지털 신호로 변환되어 컴퓨터로 전송되고 최종적으로 집계됩니다. 화면을 전체 초점면의 선명한 공초점 이미지로 전환합니다. .

각 초점면 이미지는 실제로 표본의 광학 단면입니다. 이 광학 단면은 항상 일정한 두께를 가지며 광학 얇은 단면이라고도 합니다. 초점에서의 빛의 강도는 비초점에서의 빛의 강도보다 훨씬 크고 비초점 평면의 빛은 핀홀에 의해 필터링되므로 공초점 시스템의 피사계 심도는 대략 0입니다. Z축 방향을 따라 스캐닝하면 광학 단층 촬영을 실현할 수 있으며, 샘플의 초점이 맞춰진 지점에서 원하는 2차원 광학 단면을 관찰할 수 있습니다. XY 평면(초점면) 스캐닝과 Z축(광축) 스캐닝을 결합하여 연속적인 수준의 2차원 이미지를 축적하고 이를 특수 컴퓨터 소프트웨어로 처리하여 샘플의 3차원 이미지를 얻을 수 있습니다.

즉, 검출핀홀과 광원핀홀은 항상 같은 지점에 초점이 맺히므로 초점면 외부에 여기된 형광은 검출핀홀로 들어갈 수 없다.

레이저 공초점의 작동 원리를 간단히 표현하면 레이저를 광원으로 사용한다는 것입니다. 전통적인 형광현미경 이미징을 기반으로 레이저 스캐닝 장치와 접합 포커싱 장치를 추가하고 컴퓨터로 제어하여 디지털 이미지를 수집하고 처리합니다.