형광현미경은 기존 현미경과 다릅니다.
형광현미경은 자외선을 광원으로 하여 검사 대상물에 조사하여 대상물이 빛을 내도록 한 후 현미경으로 대상물을 관찰하는 것입니다. 주로 면역형광세포에 사용됩니다. 주로 접안렌즈와 대물렌즈의 배율을 통해 시료의 형광상을 관찰하기 위한 광원, 필터 플레이트 시스템, 광학 시스템으로 구성됩니다. 이 형광현미경과 일반 광학현미경의 차이점을 살펴보겠습니다.
1. 조명 방식을 살펴보자
형광 현미경의 조명 방법은 일반적으로 표면적입니다. 즉, 광원이 대물 렌즈를 통해 테스트 샘플에 투사됩니다.
2. 해상도를 살펴보세요
형광현미경은 자외선을 광원으로 사용하며 파장은 상대적으로 짧지만 일반 광학현미경에 비해 분해능은 높다.
3. 필터의 차이
형광현미경은 두 개의 특수 필터를 사용하는데, 광원 앞에는 가시광선을 걸러내고, 대물렌즈와 접안렌즈 사이에는 자외선을 걸러내는 역할을 해 사람의 눈을 보호한다.
형광현미경도 일종의 광학현미경인데, 주로 형광현미경에 의해 여기되는 파장이 짧기 때문에, 이로 인해 형광현미경과 일반현미경의 구조와 용도에 차이가 생긴다. 대부분의 형광현미경은 약한 빛을 포착하는 기능이 뛰어나 매우 약한 형광 하에서는 이미징 능력도 좋습니다. 최근 형광현미경의 지속적인 개선으로 인해 노이즈도 크게 감소되었습니다. 따라서 점점 더 많은 형광 현미경이 사용됩니다.
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광자형광현미경에 대한 지식
2광자 여기의 기본 원리는 다음과 같습니다. 광자 밀도가 높은 경우 형광 분자는 두 개의 장파장 광자를 동시에 흡수할 수 있으며 소위 여기 상태 수명이라는 짧은 후에 더 짧은 파장의 광자를 방출할 수 있습니다. 그 효과는 형광 분자를 여기시키기 위해 장파장의 절반 파장을 갖는 광자를 사용하는 것과 같습니다. 2광자 여기에는 높은 광자 밀도가 필요합니다. 세포를 손상시키지 않기 위해 2광자 현미경은 고에너지 모드 잠금 펄스 레이저를 사용합니다. 이 레이저에서 방출되는 레이저는 피크 에너지가 높고 평균 에너지가 낮으며 펄스 폭은 100펨토초에 불과하고 주파수는 80~100MHz에 이릅니다. 펄스 레이저의 광자를 집중시키기 위해 높은 개구수 대물렌즈를 사용할 때, 대물렌즈 초점에서의 광자 밀도가 가장 높으며, 2광자 여기는 대물렌즈의 초점에서만 발생하므로 2광자 현미경에는 공초점 핀홀이 필요하지 않아 형광 검출 효율이 향상됩니다.
일반적인 형광 현상에서는 여기광의 광자 밀도가 낮기 때문에 형광 분자는 동시에 하나의 광자만 흡수한 다음 방사 전이를 통해 형광 광자를 방출할 수 있는데, 이는 단일 광자 형광입니다. 레이저를 광원으로 사용하는 형광 여기 공정의 경우 2광자 또는 심지어 다광자 형광이 발생할 수 있습니다. 이때 사용되는 여기 광원의 강도는 높고 광자 밀도는 두 개의 광자를 동시에 흡수하는 형광 분자의 요구 사항을 충족합니다. 일반 레이저를 여기 광원으로 사용하는 과정에서 광자 밀도는 여전히 2광자 흡수 현상을 일으키기에 충분하지 않습니다. 일반적으로 펨토초 펄스 레이저가 사용되며, 순간 출력은 메가와트 수준에 이릅니다. 따라서 2광자 형광의 파장은 여기광의 파장보다 짧으며, 이는 여기 파장의 절반에서 여기가 생성하는 효과와 동일합니다.
2광자 형광 현미경에는 다음과 같은 많은 장점이 있습니다.
1) 장파장 빛은 단파장 빛에 비해 산란의 영향을 덜 받고 시료에 쉽게 투과됩니다.
2) 초점면 외부의 형광 분자는 여기되지 않으므로 더 많은 여기광이 초점면에 도달할 수 있으므로 여기광이 더 깊은 표본에 침투할 수 있습니다.
3) 장파장 근적외선은 단파장 빛보다 세포에 대한 독성이 적습니다.
4) 2광자현미경을 이용하여 검체를 관찰할 경우 초점면에서만 광퇴색 및 광독성이 나타난다. 따라서 두꺼운 표본 관찰, 살아있는 세포 관찰 또는 스팟 광표백 실험에는 단일 광자 현미경보다 2광자 현미경이 더 적합합니다.
공초점형광현미경에 대한 지식
공초점형광현미경의 기본 원리: 샘플에 점광원을 조사하면 작고 잘 정의된 광점이 초점면에 형성됩니다. 점에 조사된 후 방출된 형광은 대물렌즈에 의해 수집되어 원래의 조명 경로를 따라 이색성 거울로 구성된 빔 분할기로 다시 보내집니다. 빔 스플리터는 형광을 검출기로 직접 보냅니다. 광원과 검출기 앞에는 각각 조명 핀홀과 검출 핀홀이라고 불리는 핀홀이 있습니다. 둘의 기하학적 크기는 약 100-200nm로 동일합니다. 초점면의 광점에 비해 두 개는 공액입니다. 즉, 광점이 일련의 렌즈를 통과하여 최종적으로 조명 핀홀과 감지 핀홀에 동시에 초점을 맞출 수 있습니다. 이러한 방식으로 초점면의 빛은 감지 구멍의 범위 내에서 수렴될 수 있는 반면, 초점면 위 또는 아래에서 산란된 빛은 감지 구멍 외부에서 차단되어 이미지를 얻을 수 없습니다. 레이저는 샘플을 점별로 스캔하고, 핀홀을 감지한 후 광전 증배관은 점별로 해당 광의 공초점 이미지를 얻습니다. 이 공초점 이미지는 디지털 신호로 변환되어 컴퓨터로 전송되고 최종적으로 선명한 이미지로 집계됩니다. 화면 전체 초점면의 공초점 이미지.
각 초점면 이미지는 실제로 표본의 광학 단면이며, 이 광학 단면은 항상 광학적 얇은 단면이라고도 알려진 특정 두께를 갖습니다. 초점에서의 빛의 세기는 비초점에서의 빛의 세기보다 훨씬 크고, 초점이 없는 평면의 빛은 핀홀에 의해 걸러지기 때문에 공초점 시스템의 피사계 심도는 대략 0이며, 초점을 따라 스캐닝합니다. Z축은 관찰할 시료의 초점이 맞춰진 지점에 2차원 광학 슬라이스를 형성하여 광 단층 촬영을 구현할 수 있습니다. XY 평면(초점면) 스캐닝과 Z축(광축) 스캐닝을 결합하여 연속적인 레이어의 2차원 이미지를 축적하고 특수 컴퓨터 소프트웨어로 처리하여 샘플의 3차원 이미지를 얻을 수 있습니다.
즉, 검출 핀홀과 광원 핀홀은 항상 같은 지점에 초점이 맞춰져 있기 때문에 초점면 외부에 여기된 형광은 검출 핀홀로 들어갈 수 없다.
레이저 공초점의 작동 원리를 간단히 표현하면 레이저 광을 광원으로 사용한다는 것입니다. 기존의 형광현미경 이미징을 기반으로 레이저 스캐닝 장치와 접합초점장치를 추가하여 컴퓨터 제어를 통해 디지털 이미지 획득 및 처리를 하는 시스템입니다.
