세포 연구를 위한 현미경 분류 및 작동 원리
현미경은 세포를 관찰하기 위한 기본 도구입니다. 다른 광원에 따라 광학 현미경과 전자 현미경의 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다. 전자는 가시광선(UV 현미경은 자외선을 사용)을 광원으로 사용하고 후자는 전자빔을 광원으로 사용합니다.
-,광학현미경
(1) 일반 광학현미경
일반적인 생물학적 현미경은 세 부분으로 구성됩니다. 즉, ① 광원과 콘덴서를 포함한 조명 시스템; ② 현미경의 본체인 대물렌즈와 접안렌즈로 구성된 광학배율계. 구면수차와 색수차를 없애기 위해 접안렌즈와 대물렌즈 모두 ③물체를 고정하고 관찰을 용이하게 하는 기계적 장치를 사용한다(그림 2-1).
현미경의 이미지가 선명한지 여부는 배율에 의해서만 결정되는 것이 아니라 현미경의 해상도와도 관련이 있습니다. 해상도는 물체 사이의 최소 거리를 구분할 수 있는 현미경(또는 사람의 눈이 대상에서 25cm 떨어져 있는 것)의 능력을 나타냅니다. 해상도의 크기는 다음과 같이 결정됩니다. 빛의 파장과 개구율과 매질의 굴절률은 다음 공식으로 표현됩니다.
공식에서: n=매질의 굴절률;=조리개 각도(대물 렌즈 조리개에 대한 표본의 개방 각도), NA=렌즈 조리개(숫자 조리개). 렌즈 각도는 항상 180도 미만이므로 sina/2의 최대값은 1보다 작아야 합니다.
광학렌즈를 만드는 데 사용되는 유리의 굴절률은 1.65~1.78이며, 사용되는 매질의 굴절률은 유리에 가까울수록 좋다. 건식 대물 렌즈의 경우 매체는 공기이며 렌즈 조리개 비율은 일반적으로 0.05 ~ 0.95입니다. 오일 렌즈의 경우 삼나무 오일이 매체로 사용되며 렌즈 조리개 비율은 1.5에 가깝습니다.
보통의 빛의 파장은 {0}}nm이므로 현미경의 분해능 값은 0.2μm 이상일 것이고 사람의 눈의 분해능은 0.2mm이므로 일반적인 현미경 설계의 최대 배율은 일반적으로 1000X입니다.
(2) 형광현미경
엽록소와 같은 세포의 일부 물질은 자외선에 노출된 후 형광을 발할 수 있습니다. 일부 물질 자체는 형광을 발하지 못하지만 형광염료나 형광항체로 염색한 경우 자외선 조사 시에도 형광을 발할 수 있으며 형광현미경(Fig. 2-2, 3, 4)이 그 도구 중 하나이다. 그러한 물질에 대한 정성적 및 정량적 연구를 위해.
형광 현미경과 일반 현미경은 다음과 같은 차이점이 있습니다.
1. 조명 방법은 일반적으로 에피 조명입니다. 즉, 광원이 대물 렌즈를 통해 샘플에 투사됩니다(그림 2-3).
2. 광원은 자외선이고 파장이 짧으며 일반 현미경보다 해상도가 높습니다.
3. 두 개의 특수 필터가 있는데, 광원 앞에 있는 필터는 가시광선을 걸러내는 데 사용되고 접안렌즈와 대물렌즈 사이에 있는 필터는 자외선을 걸러내어 눈을 보호합니다.
(3) 레이저 스캐닝 공초점 현미경
레이저 공초점 스캐닝 현미경(레이저 공초점 스캐닝 현미경, 그림 2-5, 6)은 레이저를 스캐닝 광원으로 사용하고 이미징을 점 단위, 선 단위, 표면 단위로 스캔하며 스캐닝 레이저와 형광 수집은 대물렌즈, 그리고 대물렌즈의 초점은 스캐닝 레이저의 초점이 순간 이미징의 물체점이기도 합니다. 레이저 빔의 파장이 짧고 빔이 매우 가늘기 때문에 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 해상도가 일반 광학 현미경의 약 3배입니다. 시스템은 한 번 초점을 맞추고 스캔은 샘플의 한 평면으로 제한됩니다. 초점 깊이가 다른 경우 샘플의 깊이 수준이 다른 이미지를 얻을 수 있습니다. 이러한 이미지 정보는 컴퓨터에 저장됩니다. 컴퓨터 분석 및 시뮬레이션을 통해 세포 샘플의 3차원 구조를 표시할 수 있습니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경은 세포 형태를 관찰할 뿐만 아니라 세포 내 생화학 성분의 정량 분석, 광학 밀도 통계 및 세포 형태 측정에도 사용할 수 있습니다.
(4) 암시야 현미경
암시야현미경(dark field microscope, 그림 2-7)은 집광기 중앙에 광시트가 있어서 조명광이 사람의 수정체에 직접 들어가지 않고 시료에 의해 반사 및 회절된 빛만 대물 렌즈에 들어갈 수 있으므로 시야의 배경은 검은색이며 물체의 가장자리는 밝습니다. 이 현미경을 사용하면 4-200nm 정도의 작은 입자도 볼 수 있고 해상도도 일반 현미경보다 50배 이상 높다.
(5) 위상차 현미경
P. Zernike가 발명한 위상차 현미경(위상차 현미경, 그림 2-8, 9)은 1932년에 발명되어 1953년 노벨 물리학상을 수상했습니다. 이 현미경의 가장 큰 특징은 염색되지 않은 표본과 살아있는 세포를 관찰할 수 있다는 점이다.
위상차 현미경의 기본 원리는 시료를 통과하는 가시광선의 광경로차를 진폭차이로 변화시켜 다양한 구조 간의 콘트라스트를 향상시키고 다양한 구조를 선명하게 보이게 하는 것이다. 빛은 시료를 통과한 후 굴절되어 원래의 광경로에서 벗어나 1/4λ(파장)만큼 지연됩니다. 진폭을 강화, 증가 또는 감소시키고 대비를 증가시킵니다. 구조면에서 위상차 현미경은 일반 광학 현미경과 다른 두 가지 특별한 기능을 가지고 있습니다.
1. 환형 다이어프램은 광원과 집광기 사이에 위치하며, 그 기능은 집광기를 통과하는 빛이 속이 빈 라이트 콘을 형성하고 시편에 초점을 맞추는 것입니다.
2. 위상판(annular phaseplate)은 대물렌즈에 불화마그네슘으로 코팅된 위상판을 추가하여 직접광 또는 회절광의 위상을 1/4λ 지연시킬 수 있습니다. 두 가지 유형이 있습니다.
①플러스 위상판: 직사광선이 1/4λ 지연됩니다. 두 그룹의 광파가 결합된 후 광파가 함께 추가되고 진폭이 증가합니다. 표본의 구조는 주변 매질보다 더 밝아서 밝은 대비(또는 음의 대비)를 형성합니다.
② B 플러스 위상판: 회절광이 1/4λ만큼 지연됩니다. 두 세트의 광선이 결합된 후 광파가 차감되고 진폭이 작아져 어두운 대비(또는 양의 대비)를 형성하고 구조가 주변 매질보다 어둡습니다.
(6) 편광현미경
편광 현미경은 필라멘트, 스핀들, 콜라겐, 염색체 등과 같은 복굴절을 가진 물질을 감지하는 데 사용됩니다. 일반 현미경과 다른 점은 광원 앞에 편광자(polarizer)가 있어 현미경에 들어오는 빛이 편광이 되고, 내부에 분석자(편광 방향이 편광자에 수직인 편광자)가 있다는 점이다. 렌즈 배럴. 이 현미경의 스테이지는 회전할 수 있습니다. 단일 굴절 물질을 무대 위에 올려 놓으면 무대를 아무리 회전해도 두 개의 편광판이 수직이기 때문에 현미경에 빛이 보이지 않고 현미경에 빛이 보이지 않습니다. 복굴절 물질에 들어갈 때 회전하는 스테이지는 빛이 이러한 물질을 통과할 때 편향되기 때문에 이러한 물체를 감지할 수 있습니다.
