미생물 수의 결정 - 현미경의 직접 계수 방법!
박테리아 집단 성장은 세포 수의 증가 또는 세포 질량의 증가로 나타납니다. 세포수를 결정하는 방법으로는 직접현미경 계수법, 판군집체 계수법, 광전유비법, 최대확률법, 막여과법 등이 있다. 세포 물질을 측정하는 방법에는 세포 건조 중량 측정, 질소, RNA 및 DNA 함량과 같은 특정 세포 성분 측정 및 대사 산물 측정이 포함됩니다. 요컨대, 미생물의 성장을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며 각각의 장점과 단점이 있으며 특정 상황에 따라 선택해야 합니다. 이 실험은 주로 생산 및 과학 연구에서 일반적으로 사용되는 현미경 직접 계수 방법을 소개합니다.
1. 목적 요건
1. 혈구 수의 원리를 명확히 한다.
2. 혈구 계수기를 사용하여 미생물을 계수하는 방법을 마스터하십시오.
2. 기본 원칙
현미경 직접 계수 방법은 특정 면적과 부피의 특수 유리 슬라이드에서 테스트할 시료의 소량의 현탁액을 직접 계수하는 간단하고 빠르며 직관적인 방법입니다(박테리아 계수기라고도 함). 행동 양식. 현재 국내외에서 일반적으로 사용되는 박테리아 계수기는 혈구 계수 보드, Peteroff-Hauser 박테리아 계수기 및 Hawksley 박테리아 계수기 등입니다. 효모, 박테리아, 곰팡이 포자 및 기타 현탁액의 계수에 사용할 수 있습니다. 기본 원리는 동일합니다. 후자의 두 종류의 박테리아 카운터는 총 부피가 0.0커버 글라스로 덮인 후 2mm3이고 커버 글라스와 슬라이드 사이의 거리는 0.02mm에 불과하므로 오일이 담금 대물 렌즈는 박테리아와 같은 작은 세포를 관찰하고 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 세다. 이들 세균계 외에도 현미경으로 직접 관찰한 시야 면적에 대한 도말면적의 비율을 추정하는 방법도 있는데, 이는 일반적으로 우유의 세균학적 검사에 사용된다. 현미경 직접 계수 방법의 장점은 직관적이고 빠르고 조작하기 쉽습니다. 그러나 이 방법의 단점은 측정 결과가 일반적으로 죽은 세포와 살아있는 세포의 합이라는 것입니다. 현재 이러한 단점을 극복하기 위한 몇 가지 방법이 있는데, 예를 들어 생균 염색 마이크로 챔버 배양(단시간)과 세포 분열 억제제를 첨가하여 생균만을 계수하는 목적을 달성하는 것입니다.
이 실험에서는 현미경으로 직접 계수하는 예로 혈구계산기를 사용했습니다. 다른 두 종류의 세균 계수기의 사용에 대해서는 각 제조업체의 지침을 참조하십시오. hemocytometer를 사용하여 현미경으로 직접 계수하는 것은 미생물을 계수하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 계수판은 3개의 플랫폼이 4개의 슬롯으로 형성되는 특수 유리 슬라이드입니다. 중앙의 더 넓은 플랫폼은 짧은 가로 슬롯에 의해 두 부분으로 나뉘며 플랫폼의 양쪽에는 그리드가 있습니다. 각 그리드는 9개의 큰 사각형으로 나뉘며 중앙의 큰 사각형은 계수실입니다. 혈구 계수판의 구조는 그림 l{{{10}}}}에 나와 있습니다. 계산실의 규모는 일반적으로 두 가지 사양이 있습니다. 하나는 큰 정사각형을 25개의 중간 정사각형으로 나누고 각 중간 정사각형은 16개의 작은 정사각형으로 나눕니다(그림 15-2). 다른 하나는 큰 광장입니다. 사각형은 16개의 중간 사각형으로 나뉘고 각 중간 사각형은 25개의 작은 사각형으로 나뉘는데 어떤 계수판이든 큰 사각형 하나에 400개의 작은 사각형이 있습니다. 각 큰 정사각형의 한 변의 길이는 1mm이고 각 큰 정사각형의 넓이는 1mm2입니다. 커버글라스로 덮은 후 커버글라스와 슬라이드글라스 사이의 높이는 0.1mm이므로 계수실의 부피는 0.lmm3(1/1000밀리리터)가 된다. 그림15-1 혈구계수판의 구조(1) 그림15-2 혈구계수판의 구조(2) 가. 정면도; B. 종단면도; 확대된 그리드, 중앙의 큰 사각형은 계수 챔버 1입니다. 혈구 계수 플레이트; 2. 커버 유리; 3. 계수실에서 계수할 때 보통 5칸의 총 세균 수를 세고 각 칸의 평균을 계산하여 25 또는 16을 곱하여 큰 사각형의 총 세균 수를 환산합니다. 세균액 1ml에 들어 있는 세균의 총수. 5칸의 총균수를 A, 균액의 희석배수를 B라 하자. 25칸의 계수판이라면 1mL의 세균액 {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(조각) 마찬가지로 16개의 중간 사각형이 있는 계수판이라면 1mL 세균 용액의 총 세균 수=A/ 5×16×104×B=32000A·B(조각)
3. 장비
1. 박테리아
사카로마이세스 세레비시애
2. 기구 또는 기타 기구
혈구계, 현미경, 커버슬립, 멸균 모세관 점적기.
4. 작업 단계
1. 세균 현탁액의 준비
Saccharomyces cerevisiae는 멸균 생리 식염수를 사용하여 적절한 농도의 박테리아 현탁액으로 준비되었습니다.
2. 현미경 계수실
샘플을 추가하기 전에 계수 플레이트의 계수 챔버를 현미경으로 검사합니다. 먼지가 있으면 계수하기 전에 청소하고 건조해야 합니다.
3. 샘플 추가
깨끗하고 건조한 혈세포계를 커버슬립으로 덮은 다음 멸균 모세관 드롭퍼를 사용하여 커버슬립 가장자리에서 흔들린 사카로마이세스 세레비지애 현탁액의 작은 방울을 떨어뜨리고 세균 용액이 모세관 삼투에 의해 자동으로 틈을 따라 이동하도록 합니다. 계수실에 들어가면 일반 계수실에 세균액을 채울 수 있습니다. 샘플링할 때 먼저 세균 용액을 흔듭니다. 샘플을 추가할 때 계수 챔버에 기포가 발생하지 않아야 합니다.
4. 현미경 계수
검체를 첨가한 후 5분 동안 그대로 둔 후 hemocytometer를 현미경 스테이지에 놓고 먼저 저배율 현미경으로 계수실의 위치를 찾은 다음 고배율 현미경으로 전환하여 계수한다. 현미경 빛의 강도를 적절하게 조정합니다. 조명을 위해 거울을 사용하는 현미경의 경우 빛의 한쪽에서 벗어나지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 시야에서 계수실의 사각형 라인을 명확하게 보기가 쉽지 않거나 수직선 또는 수평선만 비춰집니다. 볼 수 있습니다. 계수하기 전에 세균 용액이 너무 농축되거나 너무 희석된 것으로 밝혀지면 계수하기 전에 희석을 재조정해야 합니다. 일반적으로 샘플 희석에는 각 작은 세포에 약 5~10개의 박테리아가 필요합니다. 각 계수 챔버는 계수를 위해 5개의 중간 셀(선택 사항인 모서리 4개와 가운데 셀 1개)을 선택합니다. 그리드 선에 있는 셀은 일반적으로 위쪽 및 오른쪽 선에서만 계산됩니다. 효모 발아의 경우 새싹의 크기가 모세포의 절반에 이르면 2개의 세균 세포로 센다. 샘플을 계산하려면 두 개의 계수 챔버에서 평균값을 계산하여 샘플의 박테리아 함량을 계산합니다.
5. 혈구 수 세척
사용 후에는 혈구계수판을 수돗물로 헹구고, 딱딱한 물체로 문지르지 말고, 세탁 후 손으로 말리거나 헤어드라이어로 말리십시오. 각 작은 세포에 잔류 박테리아 또는 기타 침전물이 있는지 관찰하기 위한 현미경 검사. 깨끗하지 않으면 깨끗해질 때까지 반복해서 씻어야 합니다.
