형광 현미경과 일반 현미경의 차이점
1. 조명방식을 본다
형광 현미경의 조명 방법은 일반적으로 epi-type, 즉 광원이 대물 렌즈를 통해 테스트 샘플에 배치됩니다.
2. 해상도 보기
형광현미경은 상대적으로 파장이 짧은 자외선을 광원으로 사용하지만 해상도는 일반 광학현미경보다 높다.
3, 필터의 차이
형광 현미경은 두 개의 특수 필터를 사용하여 광원 앞에서 가시 광선을 걸러내고 대물 렌즈와 접안 렌즈 사이에서 자외선을 걸러내어 사람의 눈을 보호할 수 있습니다.
형광현미경도 광학현미경의 일종인데, 주로 형광현미경에 의해 여기되는 파장이 짧기 때문에 형광현미경과 일반현미경의 구조 및 용도의 차이로 이어진다. 대부분의 형광 현미경은 약한 빛을 포착하는 좋은 기능을 가지고 있습니다. , 그래서 극히 약한 형광 하에서 이미징 능력도 좋습니다. 최근 몇 년 동안 형광 현미경의 지속적인 개선과 함께 노이즈도 크게 감소했습니다. 따라서 점점 더 많은 형광 현미경이 사용됩니다.
Two-Photon Fluorescence Microscopy에 대한 지식
2광자 여기의 기본 원리는 다음과 같습니다. 높은 광자 밀도의 경우 형광 분자는 두 개의 장파장 광자를 동시에 흡수할 수 있으며 매우 짧은 소위 여기 상태 수명 후에 단파장 광자를 방출합니다. ; 그 효과는 형광 분자를 여기시키기 위해 긴 파장의 절반 파장을 가진 광자를 사용하는 것과 동일합니다. 2광자 여기에는 높은 광자 밀도가 필요하며 세포를 손상시키지 않기 위해 2광자 현미경은 고에너지 모드 고정 펄스 레이저를 사용합니다. 이 레이저는 펄스 폭이 100펨토초에 불과하고 주파수가 80~100MHz인 높은 피크 에너지와 낮은 평균 에너지의 레이저 광을 방출합니다. 높은 개구수의 대물렌즈를 사용하여 펄스레이저의 광자를 집속시킬 때 대물렌즈의 초점에서 광자 밀도가 가장 높고 2광자 여기는 대물렌즈의 초점에서만 발생하며, 따라서 2광자 현미경은 공초점 핀홀이 필요하지 않아 형광 검출 효율이 향상됩니다.
일반적인 형광 현상에서는 여기광의 낮은 광자 밀도로 인해 형광 분자가 동시에 하나의 광자를 흡수할 수 있으며, 그 후 방사 전이를 통해 형광 광자를 방출하는데, 이를 단일 광자 형광이라고 합니다. 레이저를 광원으로 하는 형광 여기 공정의 경우 2광자 또는 다광자 형광 현상이 발생할 수 있습니다. 이때 사용되는 여기광원의 강도가 높고, 광자밀도는 형광분자가 동시에 2개의 광자를 흡수하는 요건을 충족한다. 일반 레이저를 여기 광원으로 사용하는 과정에서 광자 밀도는 여전히 2 광자 흡수를 생성하기에 충분하지 않습니다. 일반적으로 펨토초 펄스 레이저가 사용되며 순간 전력은 메가와트 수준에 이를 수 있습니다. 따라서 2광자 형광의 파장은 여기광의 파장보다 짧고, 이는 반여기 파장 여기에서 생성된 효과와 동일합니다.
2광자 형광 현미경 검사에는 다음과 같은 많은 이점이 있습니다.
1) 장파장 빛은 단파장 빛보다 산란의 영향을 덜 받고 시료를 쉽게 투과할 수 있다.
2) 초점면 외부의 형광 분자는 여기되지 않으므로 더 많은 여기광이 초점면에 도달할 수 있으므로 여기광이 더 깊은 표본을 통과할 수 있습니다.
3) 장파장 근적외선은 단파장보다 세포에 대한 독성이 적습니다.
4) 이광자현미경으로 검체를 관찰할 때 광퇴색과 광독성은 초점면에만 존재한다. 따라서 2광자 현미경은 단일 광자 현미경보다 두꺼운 표본을 보거나 살아있는 세포를 보거나 고정점 광표백 실험을 수행하는 데 더 적합합니다.
공초점 형광 현미경에 대한 지식
공초점 형광 현미경의 기본 원리: 점광원을 사용하여 시편을 비추면 윤곽이 잘 정의된 작은 광점이 초점면에 형성됩니다. 빔 스플리터로 구성되어 있습니다. 빔 스플리터는 형광을 검출기로 직접 보냅니다. 광원과 검출기 앞에 각각 조명 핀홀과 검출 핀홀이라고 하는 핀홀이 있습니다. 둘의 기하학적 치수는 약 100-200nm로 동일합니다. 초점면의 광점에 대해 두 개는 공액입니다. 즉, 광점이 일련의 렌즈를 통과하고 최종적으로 조명 핀홀과 검출 핀홀에 동시에 초점을 맞출 수 있습니다. 이러한 방식으로, 초점면으로부터의 빛은 감지 구멍의 범위 내에 집중될 수 있는 반면, 초점면 위 또는 아래로부터 산란된 빛은 감지 구멍 밖으로 차단되어 이미지화될 수 없습니다. 샘플은 레이저로 한점 한점 스캔하고 핀홀을 감지한 후 광전자 증배관은 해당 광점의 공초점 이미지를 한점씩 얻어 디지털 신호로 변환되어 컴퓨터로 전송되어 최종적으로 집적됩니다. 전체 초점 평면의 명확한 공초점 이미지로 스크린. .
각 초점 평면 이미지는 실제로 시편의 광학 단면이며, 이 광학 단면은 항상 광학 슬라이스라고도 하는 특정 두께를 가집니다. 초점에서 빛의 강도가 비초점에서보다 훨씬 크고 비초점 평면 빛이 핀홀에 의해 걸러지기 때문에 공초점 시스템의 피사계 심도는 거의 0이 되며, Z축은 광학 단층 촬영을 구현하여 샘플의 초점이 맞춰진 지점에서 2차원 광학 섹션을 관찰합니다. XY 평면(초점면) 스캐닝과 Z축(광축) 스캐닝을 결합하여 연속 레이어의 2차원 이미지를 축적하고 특수 컴퓨터 소프트웨어로 처리하여 샘플의 3차원 이미지를 얻을 수 있습니다.
즉, 검출 핀홀과 광원 핀홀은 항상 같은 지점에 포커싱되어 포커싱 평면 외부에서 여기된 형광이 검출 핀홀로 들어갈 수 없다.
공초점 레이저의 작동원리를 간단하게 표현하면 레이저를 광원으로 사용하고 전통적인 형광현미경 이미징을 기반으로 레이저 스캐닝 장치와 공액 포커싱 장치를 부착하고 디지털 영상 획득 및 처리 시스템은 컴퓨터에 의해 제어됩니다.
