다광자 현미경 이미징: 생체 내 뉴런 이미징을 위한 다양한 기술
기존의 단일 광자 광시야 형광 현미경과 비교하여 다광자 현미경(MPM)은 광학 절편 및 심층 이미징 기능을 가지고 있습니다. 2019년 Jerome Lecoq et al. 관련 MPM 기술은 뇌 깊은 곳의 뉴런 이미징, 대규모 뉴런 이미징, 고속 뉴런 이미징의 세 가지 측면에서 논의되었습니다.
뉴런 활동을 복잡한 행동과 연결하기 위해서는 일반적으로 깊은 피질의 뉴런을 이미지화하는 것이 필요하며, 이를 위해서는 MPM이 깊은 이미징 능력을 가져야 합니다. 여기 및 방출 광은 MPM의 이미징 깊이를 제한하는 주요 요인인 생물학적 조직에 의해 고도로 산란되고 흡수됩니다. 레이저 강도를 높이면 산란 문제를 해결할 수 있지만 샘플 연소, 디포커싱 및 표면 근처 형광 여기와 같은 다른 문제가 발생합니다. MPM 이미징의 깊이를 증가시키는 가장 좋은 방법은 더 긴 파장을 여기광으로 사용하는 것입니다.
또한 2광자(2P) 이미징의 경우 아웃포커스(out-of-focus) 및 근표면(near-surface) 형광 여기(excitation)가 가장 큰 두 가지 깊이 제한 요인인 반면, 3광자(3P) 이미징의 경우 이 두 가지 문제가 크게 감소하지만 형광으로 인한 3광자 이미징 그룹의 흡수 단면적은 2P보다 훨씬 작기 때문에 2P에 의해 여기된 것과 동일한 강도의 형광 신호를 얻기 위해서는 훨씬 더 높은 펄스 에너지가 필요합니다. 기능적 3P 현미경은 신경 활동을 적시에 샘플링하기 위해 더 빠른 스캐닝이 필요한 구조적 3P 현미경보다 더 까다롭습니다. 각 픽셀의 드웰 시간 내에 충분한 신호를 수집하려면 더 높은 펄스 에너지가 필요합니다.
복잡한 행동에는 종종 로컬 및 장거리 연결이 모두 있는 대규모 두뇌 네트워크가 포함됩니다. 뉴런 활동을 행동과 연결하려면 매우 크고 널리 분포된 뉴런의 활동을 동시에 모니터링해야 합니다. 뇌의 신경망은 들어오는 자극을 수십 밀리초 이내에 처리합니다. 이 빠른 신경망을 이해하려면 뉴런 역학을 연구하기 위해 MPM은 뉴런을 빠르게 이미지화할 수 있는 능력이 필요합니다. 고속 MPM 방법은 단일 빔 스캐닝 기술과 다중 빔 스캐닝 기술로 나눌 수 있습니다.
단일 빔 스캐닝 기술로 넓은 시야(FOV)로 신경 조직의 고속 통과 가능
MPM을 사용하여 뉴런을 이미지화할 때 랜덤 액세스 스캐닝(즉, 레이저 빔이 전체 시야의 선택된 지점에서 빠르게 스캔됨)은 관심 있는 뉴런만 스캔할 수 있습니다. 또한 레이저 빔의 스캐닝 시간을 최적화합니다. 랜덤 액세스 스캐닝(그림 1)은 음향 광학 디플렉터(AOD)를 사용하여 수행할 수 있습니다. AOD는 무선 주파수 신호가 있는 압전 변환기를 적합한 수정에 결합하여 작동합니다. 결과적인 음파는 주기적인 굴절률 격자를 유도합니다. 회절은 레이저 빔이 격자를 통과할 때 발생합니다. 무선 주파수 전기 신호에 의해 음파의 세기와 주파수를 조절하여 회절광의 세기와 방향을 바꿀 수 있어 하나의 AOD를 사용하여 1차원 수평 임의 점 스캐닝을 실현하고 3D를 구현할 수 있다. 다른 축 스캐닝 기술 랜덤 액세스 스캐닝과 결합된 한 쌍의 AOD를 사용합니다. 그러나 이 기술은 샘플의 움직임에 매우 민감하고 움직임 아티팩트가 발생하기 쉽습니다. 현재 고속 래스터 스캐닝, 즉 FOV에서의 프로그레시브 스캐닝은 알고리즘이 모션 아티팩트를 쉽게 해결할 수 있기 때문에 널리 사용됩니다.
생체 내 신피질 L2/3 뉴런의 AOD 기반 2광자 이미징[2]
빠른 래스터 스캐닝을 구현하는 방법에는 진동 거울을 사용하여 빠른 2D 스캐닝을 하는 방법, 진동 거울과 조정 가능한 전자 렌즈를 결합하여 빠른 3D 스캐닝을 하는 방법 등 여러 가지 방법이 있지만 조정 가능한 전자 렌즈는 이미징 속도에 영향을 미치는 기계적 관성 스위칭은 이제 공간 광 변조기(SLM)로 대체될 수 있습니다.
원격 포커싱은 그림 2와 같이 3D 이미징을 달성하는 수단이기도 합니다. LSU 모듈에서 스캐닝 검류계는 수평으로 스캔하고 ASU 모듈은 대물 렌즈 L1과 미러 M을 포함하며 축 방향 스캐닝은 조정하여 구현됩니다. M의 위치. 이 기술은 주 대물 렌즈 L2에 의해 도입된 광학 수차를 보정할 수 있을 뿐만 아니라 빠른 축 주사를 가능하게 합니다. 더 많은 뉴런 이미징을 얻기 위해 현미경의 대물렌즈 설계를 조정하여 FOV를 확대할 수 있지만 큰 NA와 큰 FOV를 가진 대물렌즈는 일반적으로 무겁고 빠른 축 스캔을 위해 빠르게 움직일 수 없기 때문에 큰 FOV 시스템은 Telefocus에 의존합니다. , SLM 및 조정 가능한 전동 렌즈.
원격 초점 2광자 이미징 시스템의 개략도[3] 다중 빔 스캐닝 기술은 신경 조직의 서로 다른 위치를 동시에 이미지화할 수 있습니다.
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2mm 떨어져 있음) 이미징 사이트(그림 3C,D); 인접한 영역의 경우 일반적으로 이미징을 위해 단일 대물 렌즈의 여러 빔을 사용합니다(그림 3E,F). 다중 빔 스캐닝 기술은 여기 빔 사이의 혼선 문제에 특별한 주의를 기울여야 하며, 이는 광원 후 분리 방법 또는 시공간 다중화 방법으로 해결할 수 있습니다. 사후 광원 분리 방법은 누화를 제거하기 위해 빔을 분리하는 알고리즘을 사용하는 것을 말합니다. 시공간 다중화 방법은 여러 개의 여기 빔을 동시에 사용하는 것을 말하며, 각 빔의 펄스는 시간적으로 지연되어 서로 다른 빔에 의해 여기된 개별 빔을 일시적으로 분리할 수 있습니다. 형광 신호. 더 많은 빔을 도입하여 더 많은 뉴런을 이미지화할 수 있지만 다중 빔은 형광 붕괴 시간의 중첩을 증가시켜 신호 소스를 구별하는 기능을 제한합니다. 다중화는 전자 장치의 작업 속도에 부정적인 영향을 미칩니다. 높은 요구 사항; 많은 수의 빔은 또한 단일 빔의 대략적인 신호 대 잡음비를 유지하기 위해 더 높은 레이저 출력을 필요로 하므로 쉽게 조직 손상을 초래할 수 있습니다.
대면적 이미징 기술
최근 몇 년 동안 다양한 MPM 기술의 개발로 신경 조직 이미징의 범위가 넓어져 더 빠른 속도로 뇌 깊숙한 더 많은 뉴런을 이미지화할 수 있게 되었습니다. 뇌 기능의.
