염색기술 및 미생물의 현미경 관찰
1. 목적
1.1 미생물 도말 및 염색의 기본 기술을 배웁니다.
1.2 박테리아의 간단한 염색법을 마스터하세요.
1.3 세균의 형태학적 특성을 사전에 이해하고, 오일렌즈의 사용법과 무균수술법에 대한 지식을 다진다.
2가지 원칙
박테리아의 도말 및 염색은 미생물학 실험의 기본 기술입니다. 박테리아 세포는 작고 투명하여 일반 광학현미경으로 식별하기 어렵습니다. 얼룩이 있어야합니다. 단일염료를 사용하여 세균을 염색함으로써, 염색된 세균이 배경과 뚜렷한 색차를 이루므로 형태와 구조를 보다 명확하게 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 조작이 쉽고 박테리아 세포의 일반적인 모양과 박테리아의 배열을 관찰하는 데 적합합니다. 단순 염색에는 기본 염료가 일반적으로 사용됩니다. 이는 중성, 알칼리성 또는 약산성 용액에서는 세균 세포가 대개 음전하를 띠고 염기성 염료가 이온화되면 분자의 염색 부분이 양전하를 띠므로 알칼리성이 되기 때문입니다. 염료의 염색되는 부분은 박테리아와 쉽게 결합하여 착색됩니다. 염색된 박테리아 세포는 배경과 뚜렷한 대조를 이루므로 현미경으로 쉽게 식별할 수 있습니다. 단순염색에 흔히 사용되는 염료로는 메틸렌블루, 크리스탈바이올렛, 염기성푹신 등이 있다. 세균이 당을 분해하여 산을 생성하여 배양배지의 pH가 낮아지면 세균의 양전하가 증가한다. 이때 염색에는 에오신(eosin), 산성 푹신(acid fuchsin), 콩고레드(Congo red) 등의 산성염료를 사용할 수 있다. 염색하기 전에 박테리아를 고정해야 합니다. 여기에는 두 가지 목적이 있습니다. 하나는 박테리아를 죽이고 유리 슬라이드에 부착시키는 것입니다. 다른 하나는 염료에 대한 친화력을 높이는 것입니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 방법은 가열과 화학적 고정입니다. 고정 시에는 세포의 원래 모양을 유지하도록 노력하세요.
3가지 재료
3.1 세균: Bacillus subtilis 12-18h 영양한천사면배양, 황색포도상구균 24시간 영양한천사면배양, 대장균 24시간 영양한천사면배양, 빵효모 한천사면배양.
3.2 염색제: 루의 알칼리성 메틸렌 블루 염료(또는 옥살산암모늄 크리스탈 바이올렛 염료), 카르볼산 푹신 염료.
3.3 기구 또는 기타 기구: 현미경, 알코올 램프, 슬라이드, 접종 루프, 슬라이드 랙, 이중병(삼나무유 및 자일렌 함유), 렌즈 티슈, 생리식염수 또는 증류수 등
4. 공정 : 도말 → 건조 → 고정 → 염색 → 세척 → 건조 → 현미경 검사.
5단계
5.1 도말: 깨끗하고 기름이 없는 유리 슬라이드 2개를 준비합니다. 멸균 상태에서 유리 슬라이드의 각 중앙에 생리식염수(또는 증류수)를 한 방울씩 떨어뜨립니다. 접종 루프를 사용하여 Bacillus subtilis의 박테리아를 소독합니다. , Micrococcus luteus 및 Escherichia coli는 경사면의 물방울에 있는 작은 세균 잔디를 골라 잘 섞은 후 얇은 필름으로 도포합니다. 세균 현탁액(또는 액체 배양) 도말을 사용하는 경우 접종 루프를 사용하여 2~3개의 루프를 골라 슬라이드에 직접 적용할 수 있습니다. 생리식염수(증류수)를 너무 많이 떨어뜨리지 않도록 주의하고, 세균을 제거한 후 너무 두껍지 않게 균일하게 도포해 줍니다.
5.2 건조 실온에서 자연 건조합니다. 코팅된 면이 위로 향하게 하여 알코올 램프 위에서 살짝 가열하여 건조시켜도 됩니다. 그러나 온도가 너무 높으면 박테리아의 형태가 파괴될 수 있으므로 불꽃에 너무 가까이 접근하지 마십시오.
5.3 고정 가열건조를 이용하는 경우에는 고정과 건조가 한 단계로 결합되며 방법은 건조와 동일하다. 도말, 건조 및 열 고정.
5.4 염색: 슬라이드를 슬라이드 랙에 편평하게 놓고 도말 위에 염료 용액 1~2방울을 추가합니다(염료 용액이 도말 필름을 덮는 정도가 적당합니다). 루염기성 메틸렌블루로 1~2분간 염색하고, 카르볼산 푹신(또는 암모늄 옥살레이트 크리스탈 바이올렛)으로 1분간 염색한다.
5.5 물로 세척: 염료 용액을 붓고 도말에서 흘러내리는 물이 무색이 될 때까지 슬라이드 한쪽 끝에서 수돗물로 부드럽게 헹굽니다. 물 세척시 코팅된 표면을 직접 물로 세척하지 마세요. 물 흐름은 도말 필름이 떨어지는 것을 방지하기 위해 너무 빠르거나 너무 커서는 안됩니다.
5.6 건조 : 슬라이드에 붙은 물방울을 털어내고 자연 건조시킨 후, 헤어드라이어로 불어 건조시키거나 흡수지로 흡수시켜 주십시오. (균이 지워지지 않도록 주의하세요) 5.7 현미경 검사 도말이 건조된 후 현미경 검사를 실시한다. 오일 렌즈로 보기 전에 도말이 완전히 건조되어야 합니다.
6 결과 단일염색 후 관찰된 E. coli와 Micrococcus luteus의 형태를 그려라.
